《分子生物学实验指导》是一本简明实用且与目前高等学校分子生物学实验教学相适应的实验指导用书。第二版《分子生物学实验指导》仍分为两篇,**篇简明介绍了分子生物学的实验方法和理论;第二篇选编了18个学生实验,包括感受态细胞的制备和转化,质粒DNA的提取和分析,琼脂糖凝胶电泳检测DNA,PCR基因扩增,DNA重组,动物、植物、大肠杆菌基因组DNA的分离和分析,DNA序列测定,基因表达和检测,蛋白质印迹,植物总RNA的提取,定点突变,RT—PCR,差异显示mRNA,Southern杂交等内容。书中详细叙述了常用方法的实际操作,并对实验中应注意的地方给予了提示,初学者依此即可开展工作,并可获得满意的结果。书后还有各种有用的附录。
《分子生物学实验指导》可作为高等院校生物类及农林、医药类开设分子生物学实验的各专业教学用书,也可供有关研究人员、技术人员和中学生物教师参考。

**章 载体
基因工程中,携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具,称为载体。目前使用的已知载体除了大肠杆菌中的质粒,R噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外,还有酵母、细菌人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。
作为基因工程中使用的载体必须具备以下条件:①复制子:是一段具有特殊结构的DNA序列,载体有复制子才能使与它结合的外源基因复制繁殖;②有一个或多个利于检测的遗传表型,如抗药性、显色表型反应等等;③有1个到几个限制性内切酶的单一识别位点,便于外源基因的插入;④适当的拷贝数,一般而言,较高的拷贝数不仅利于载体的制备,同时还会使细胞中克隆基因的剂量增加。
一、质粒
质粒是基因工程中常用的载体之一。质粒是染色体外小型双链环状的DNA,大小在1~200 kb之间。质粒能自主复制,在细菌中不断复制自身。在细胞内的复制分成两种类型:一种是低拷贝数的质粒,每个细胞仅含有1个或几个质粒分子,称这种类型为“严紧型”复制的质粒;另一类是高拷贝数的质粒,一般在20个以上,称这种类型为“松弛型”复制的质粒。
质粒能编码一些遗传性状,如抗药性(如抗青霉素、抗四环素、耐受重金属、产生细菌素等),被质粒转化的细菌也获得了这些额外的特性。
1.pBR322
pBR322是由几个质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的克隆载体。具有较小的相对分子质量,DNA分子的长度为4 361 bp;具有青霉素和四环素两种选择的抗药性标记(图1—1)。pBR322共有24种限制性内切酶的单一的识别位点,其中7种酶(EcoR Ⅰ,NheⅠ,BamH Ⅰ,Sph Ⅰ,Sal Ⅰ,XmaⅢ,Nru Ⅰ)的识别位点位于四环素抗性基因内部,2种酶(Cla Ⅰ,HindⅢ)存在于这个基因的启动子内部。所以在这9个限制性位点上插入外源DNA通常都会导致四环素抗性基因(tet`)的失活。3种酶(Sca Ⅰ,Pvu Ⅰ,PstⅠ)在青霉素抗性基因(Amp`)内具单一的识别位点,在这个位点插入外源DNA则会导致Amp`基因的失活。 分子生物学作为21世纪的前沿科学,一直在与时俱进,学科进展十分迅速,研究方法与科研成果日新月异,了解、熟悉和掌握分子生物学技术,对于理解学科研究思路和成就、把握学科动态、应用学科知识至关重要,也是全面提高人才培养素质的关键所在。
本书**版自1999年出版以来,深受广大读者的欢迎。多年来为了更好地培养读者尤其是本科生的实践技能和科研素质,我们在教学实践中,不断改革探索、总结经验。本次再版,结合我们的实践教学经验和生物学技术的发展,在**篇的用分子生物学实验技术及原理中增加了“MRNA差异显示技术”一章,同时在其余章节中也注入了新的内容;在第二篇的学生实验部分删去了“酵母tRNA的制备”和“鼠肝氨酰tRNA合成酶的制备及tRNA接受氨基酸活力的测定”两个目前技术方法不常用的实验项目,增加了“大肠杆菌基因组DNA的提取”、“RT-PCR”和“PCR法差异显示MRNA”三个新的实验技术项目。同时也调整了部分实验项目的顺序,并在部分实验项目中增加了新的内容。
本书第二版仍保持了**版简明、实用、易于普及的编写宗旨和编写风格。设计体系更接近于分子生物学的科研思路,以便读者通过本书的系统学习,在获得较好实验结果的同时即可进行接近正规科学研究的综合实验技能训练,从而达到培养和提高广大读者的科研能力、创新能力、分析问题与解决问题能力和综合实践能力。
由于我们的水平有限,希望读者在使用过程中,对我们教材的不当之处,提出批评指正。

**篇 常用分子生物学实验技术及原理
**章 载体
第二章 分子生物学中常用的工具酶
第三章 电泳
第四章 真核生物基因组文库的构建
第五章 eDNA文库的构建
第六章 DNA序列测定
第七章 PCR基因扩增
第八章 基因表达
第九章 印迹法及分子检测
第十章 克隆化DNA的定点突变
第十一章 mRNA差异显示技术

第二篇 学生实验
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化
实验二 质粒DNA的提取及其定性定、量分析
实验三 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
实验四 PCR基因扩增及扩增产物的回收
实验五 DNA重组
实验六 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测
实验七 蛋白质印迹
实验八 哺乳动物基因组DNA的分离和分析
实验九 植物基因组DNA的提取
实验十 大肠杆菌基因组DNA的提取
实验十一 植物总RNA的提取
实验十二 RT-PCR(反转录一聚合酶链反应)
实验十三 PCR法差异显示mRNA
实验十四 利用聚合酶链反应(PCR)定点突变
实验十五 寡核苷酸介导的定点突变
实验十六 Southern杂交
实验十七 双脱氧链终止法测定DNA序列
实验十八 DNA核苷酸序列分析——银染色法

附录
一、常用核酸、蛋白质换算数据
二、氨基酸符号及相应密码子
三、常见市售酸碱的浓度
四、离心机转速与相对离心力的换算
五、常用电泳缓冲液及凝胶加样缓冲液
六、常用限制酶酶切位点及缓冲液
七、分子生物学常用试剂和缓冲液的配制
八、常用细菌培养基和抗生素溶液
九、x光底片的冲洗方法
十、溴化乙锭溶液的净化处理
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