《生物化学技术原理及应用》是在第四版的基础上,结合近几年来科学进展修订而成。《生物化学技术原理及应用》共分3编,20章:**编概述蛋白质、核酸等生命大分子物质的制备方法及基本要点;第二编讲解从动物、植物和微生物材料中分离纯化上述物质的常见方法,如离子交换层析、疏水层析、亲和层析、聚焦层析、凝胶过滤、**液相色谱、沉淀法等;第三编介绍鉴定生命大分子物质所涉及的相关方法,如同位素标记(包括DNA、RNA和蛋白质的标记)、基因重组、DNA序列测定、生物芯片、聚合酶链反应(包括DNA和RNA的扩增)、电泳(包括各种聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳等)、免疫分析(包括多克隆和单克隆抗体的制备、免疫扩散、各种免疫电泳、固相免疫吸附法——酶联免疫吸附法和免疫印迹法等)、薄层与薄膜层析、气相色谱、分光光度法和离心法等。《生物化学技术原理及应用》在阐明各类方法基本原理的同时,还讲述了主要操作、注意事项及应用实例,在每章末尾附有思考题和主要参考文献,《生物化学技术原理及应用》共有图、表360余幅。 生物化学技术原理及应用(第五版)_赵永芳_科学出版社_

**编 概述
**章 生命大分子物质的制备
生命大分子物质通常是指动物、植物和微生物在进行生长发育、新陈代谢时,所形成的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称。它不仅是一些生物科学工作者研究、探索的主要对象,还与广大从事化工、医学和食品等学科的人员密切相关。在这些方面,特别是科研方面,随着人类基因组的30亿碱基对测序工作的完成,生命科学研究已进入后基因组时代(研究的焦点将从基因的序列转移到功能方面)。为鉴定大量未知蛋白质(酶)的结构和功能,蛋白质研究也将进入一个**活跃的时期,因此分离纯化和测试分析蛋白质技术显得十分重要。首先,蛋白质与核酸(包括DNA、rRNA、mRNA和tRNA等)相比,蛋白质的结构(包括一级结构和空间结构)更具有奇妙独特的复杂性和艺术性��它是由20多个不同性质(或极性)的氨基酸交互排列而成,不但潜在的数量多(约100亿个),而且相互间差异大。而核酸的结构,虽然也有异乎寻常的多样性,但是,它是由结构相似、理化性质接近的4个碱基交互排列而成的,且有一定规律可循。相对而言,蛋白质的分离、纯化和鉴定有较大的难度和特殊性。而核酸的分离、制备和鉴定则比较容易,有捷径可走。其次,蛋白质和核酸类物质通常是与自然界存在的诸多不同化合物结合在一起,或者是不同蛋白质、不同核酸自身相互组合在一起出现的,加之它们稳定性较差(如离体后的多数酶)、含量相对偏低,使提取分离过程变得更加困难。*后,提取生命物质的材料五花八门、千变万化,所用的方法通用性较差,尤其是提取分离蛋白质的方法更是如此,这也给制备工作带来了麻烦和困惑。尽管如此错综复杂,却也不是无轨迹可寻。另外,在实践中,确实非常需要一定纯度或较高纯度的生命大分子物质。因此,人们在细心观察、认真归纳制备这些物质的程序时,也发现了不少类似操作和共同点,对制备生命大分子物质很有裨益。本章将以蛋白质和核酸为主线讨论其制备的共有特质和一般过程,其中包括材料的选择与处理、测定方法的确立、有效成分的抽提、粗品的纯化和纯品的鉴定(分别见后面各编评述)等相关步骤。
**节 材料的选择与处理
一、材料的选择在进行材料的选择时,常会提及有效成分一词。所谓有效成分是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其他物质则统称杂质。在动物、植物和微生物材料中,有效成分的含量一般较少,如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一。此外,有效成分稳定性较差,大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感,而且容易被微生物分解变质。因此,提取有效成分的成功与否,与选用的材料关系密切。如果选用的材料不同,有效成分的含量就不一样;选用的材料即使相同,但是部位、生长期、生长地区或存放时间不同,有效成分的含量也不尽相同。总的来说,材料选择应遵循的原则是:有效成分含量多、稳定性好;来源丰富、保持新鲜;提取容易、工艺简单;杂质有综合利用价值等。在实践过程中则需抓主要矛盾,全面考虑,综合权衡。例如,胰岛素,从含量看,在牛胰脏中比猪的高,但从我国实际出发,全国猪的饲养头数远比牛多,加之牛可拉车、耕田,因此制备胰岛素一般不选用牛胰脏而选用猪胰脏作材料。磷酸单酯酶,就含量而言,虽然在胰脏、肝脏和脾脏中较丰富,但是因其与磷酸二酯酶共存,进行提纯时,这两种酶很难分开,所以实践中常选用含磷酸单酯酶少、几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。
二、材料的处理
选择到合适的材料后,应及时使用,否则所需的有效成分会部分甚至全部被破坏变性,从而影响收得率。例如,从猪肠黏膜提取肝素时,如果用新鲜材料,每千克小肠可得肝素钠5万~6万U。如将材料置25℃以上的室温存放约1h,肝素钠的含量会显著下降。其原因是,猪小肠内的大量微生物(2 5×108~3×108个/g)不停地繁殖(如大肠杆菌约20min繁殖一次),有的会产生降解肝素的酶系。若选择的材料难于立即使用时,一般应采用冰冻或干燥等方法处理,同时还应将易于去掉的非需物质(如脂类)除去。因常选用的动物、植物和微生物材料的特性各异,故处理要求也不完全相同。
(一) 动物脏器
1 冰冻从刚宰杀的牲畜得到的脏器(脑组织、心脏等)要迅速剥去脂肪和筋皮等结缔组织,立即冲洗干净。若不能马上抽提、纯化时,应及时移至-10℃冰库(可短时间保存)或-70℃低温冰箱(数月不变质)贮存。
脏器中常含有较多的脂肪,该物质不仅容易氧化酸败,导致原料变质,还会影响纯化操作和制品得率。脱脂操作可在提纯前进行,也可在提纯过程中进行,具体实施应视材料而定。一般脱脂的方法有:人工剥去脏器外的脂肪组织;浸泡在脂溶性的有机溶剂(如丙酮、乙醚)中脱脂;采用快速加热(50℃左右)、快速冷却的方法,使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去;利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。
2 干燥
对于像脑下垂体一类的小组织,可置丙酮液中脱水,干燥后磨粉贮存备用;对于含耐高温有效成分(如肝素)的肠黏膜,可在沸水中蒸煮处理,烘干后能长期保存。
(二)植物组织
由室内栽培或野外采集的植物材料,若是植物(如菠菜、芹菜)的叶片,需用清水洗净方可使用,或置-30~-4℃冰箱贮藏,可在10h内使用;若是植物的种子,则需泡胀或粉碎后才可使用。如材料中含油脂较多时,也要进行脱脂处理。
(三)微生物
由于微生物具有种类多、繁殖快、培养简便、诱变容易和不受季节影响等优点,因此,它已成为制备生命大分子物质的主要材料之一。当选用的微生物接种于适当的培养液培养一段时间后,用离心法收集到的上清液,即可用于制备胞外酶和某些辅基等有效成分。而收集到的菌体,经破细胞处理后则可从中提取其他有效成分,如胞内酶。前者可置低温下短时间贮存,后者可制成冻干粉,在4℃保存。例如,收集的黄杆菌(Flavobacterium sp.)P32细胞,用0 05mol/L TrisHCl缓冲液(pH7 5)洗两次,进行冻干处理可得到红棕色的干粉。将其置4℃保存3个月,检测降解对硫磷水解酶活力的影响时,发现无明显影响。
第二节 测定方法的确立
一、目的与要求当纯化的对象即某一有效成分选定后,首先碰到的问题是,此物质在哪些材料中含有?哪些材料中含量较丰富?其次是在从选定的材料提纯此物质的过程中,杂质是否逐渐减少?纯度是否逐渐增加?也就是说,所用的纯化方案是基本合理或部分合理,还是根本不妥?要回答这些问题,就必须确立一种专一、灵敏和简便快速的测定方法。不然,很难对其作出准确、定量的判断。
**节提到,有效成分在原材料中含量较低。这一事实决定了抽提液和纯化的前一阶段溶液中有效成分的比活性较小,加之此时测定的样品很多(每一步骤都须测定),因而确立的测定方法应简单、灵敏、省时、快速,除此之外,还要有较好的专一性,否则,所测得的结果误差大,不可靠。例如,在从原料中纯化某一酶蛋白时,测定其含量的依据常常是在酶与底物反应后,以产物形成或底物降低的数量来表示的。若选择的底物是非专一性的,或者选择的产物不是待测酶特异催化形成的,这样测出的数值就包含有原料中杂质所消耗的底物或形成的产物,影响了酶活性的真实性。
二、常用的测定方法
(一)光谱法由于不同生命大分子物质与相应波长的光会发生特定的作用,而依据作用结果即可推断出被测物质的含量和部分理化性质。人们称这类测定方法为光谱法。该法通常包括紫外光谱法、可见光光谱法、荧光光谱法和浊度法等。紫外光谱法是利用某些生物大分子物质具有吸收紫外线的性质而建立的一种方法;可见光光谱法是利用生命大分子物质的一些特殊结构先与相关试剂反应生成不同颜色后,借助可见光检测物质而建立的一种方法;荧光光谱法是利用有些生命大分子物质自身可以吸收特定光波的能量后,依赖发出荧光的特性而建立的一种方法;浊度法是利用测定不同浓度的稀悬浮液,在不被吸收的光波长条件下,测定其表观吸光值而建立的一种方法。
将待测物(如核酸、蛋白质)配制成一定浓度的溶液后,注入石英杯,移至相应波长的分光光度计中,即可从测定的吸光值换算出待测物的含量。
1 紫外光谱法
1)测定核酸含量构成核酸的碱基组分是分光光度计测定核酸含量的依据。在波长260nm测定过程中,DNA或RNA溶液浓度的**或降低,会使其吸光值(A260)随之发生**或降低变化,二者之间呈正比关系。通常1个A260分别相当于50μg/ml双链DNA、37μg/ml单链DNA和40μg/ml单链RNA。另外,用A260/A280可确定DNA和RNA的纯度(纯DNA和纯RNA的比值分别为1 8和2 0),当此比值分别小于1 8和2 0时,表明样品中已污染了蛋白质或酚类等物质。
2)测定蛋白质的含量及纯度蛋白质(包括酶和肽)溶液的A280主要是由构成蛋白质组分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的吸光值决定的,胱氨酸(Cys)的贡献很小。大肠杆菌RNA聚合酶σ32因子及其Tyr、Trp和Cys的摩尔吸光系数和氨基酸含量见表11。
由表11中数据可见,其摩尔吸光系数与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的很相似。所谓摩尔吸光系数是指某物(如BSA)在1mol/L 浓度时,置特定波长(如280nm)下测定出的吸光值,对一个纯物质来说,该值在特定条件下应该是个恒定值。同样百分吸光系数(某物在1%浓度时,特定条件下所测定的吸光值)无疑也是个恒定值。不同物质因结构的差异性或Tyr、Trp等氨基酸含量的不同,测出的吸光系数也各不相同。
2 可见光光谱法
将待测物(如蛋白质、核酸、糖类)与相关试剂(表12)或酶的底物作用后,注入玻璃杯,根据呈现的颜色或形成的产物特性,移至相应波长的分光光度计中,即可从测定的吸光值换算出待测物的含量。例如,邻苯二酚(275nm有吸收峰)在邻苯二酚2,3双加氧酶的作用下,可转化为黄色的α羟基粘康酸半醛(375nm有吸收峰),通过检测375nm吸光值的升高,即可换算出所用酶的活性单位。
另外,还可用不同吸光值之间的比值鉴定某些物质的纯度。例如,纯细胞色素c还原型A550/氧化型A280为1 25~1 28。假如比值过高或过低,就表明细胞色素c被污染。
3 荧光光谱法
荧光光谱法的**性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。当分析物含量低、用吸收光谱法不能检测时, 改用荧光光谱法却能求得满意结果。例如,NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的连锁反应是由于NADH2和NADPH2发荧光,因此它们可用于偶联NADH2(或NADPH2)的氧化或 NAD(或NADP) 的还原反应系统进行荧光测定。通常谷草转氨酶(glutamicoxaloacetic transaminase,GOT)活性测定,是采用与苹果酸脱氢酶(malicdehydrogenase,MDH)相偶联反应进行:
4 浊度法
通过测定某物质的表观吸光值,即可求出其含量。例如,伴刀豆球蛋白(concanavalin,Con A)的活性测定方法之一就是采用此法完成的。即将一定浓度的Con A 溶液与糖原反应后,可产生相应浊度且无沉淀的悬浮液,测定420nm波长下的吸光值(A420),即能求出Con A的活性或浓度,此法也可用于分析培养液中细菌(如E. coli)生长的状况,即定时取样,检测其波长600nm的表观吸光值(A600),即可求出相关细菌的浓度。
(二)电化学法
有些化学反应过程放出质子氢(H+),可用灵敏的pH计或NaOH溶液滴定等方法追踪其变化,从而计算出欲测物的含量或活性。例如,葡糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,用NaOH溶液滴定该酸的含量,便可求出葡糖氧化酶的活性。一种细菌No 66的脱氯酶能催化单氯乙酸和(或)二氯乙酸释放出Cl-,使所处溶液的pH降低。这些Cl-的浓度,可用氯离子选择电极和双液参比电极进行测定。
(三)生物活性检测法
大多数生命物质,尤其是一些激素类物质,当把它们注射入动物的特定器官时,所属机体将发生相应的变化,并且二者间有一定的相关性。根据这一性质设计的方法,即可对生命活性物质进行检测。例如,人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)能使小鼠子宫加速增殖,因此通过检

第五版前言
第四版前言
第三版前言
**编概述
**章 生命大分子物质的制备2
**节 材料的选择与处理2
一、材料的选择2
二、材料的处理3
第二节 测定方法的确立4
一、目的与要求4
二、常用的测定方法4
第三节 细胞破碎7
一、机械破碎7
二、溶胀和自溶8
三、化学处理8
四、生物酶降解8
第四节 抽提9
一、抽提的含义9
二、抽提有效成分的影响因子9
第五节 浓缩12
一、沉淀法12
二、吸附法12
三、超过滤法12
四、透析法13
五、离心法13
六、干燥法13
第六节 纯化方案的设计与评价14
一、纯化方案的设计14
二、纯化方案的评价15
第七节 有效成分纯度和性质的分析16
第八节 应用实例16
一、高纯度人转铁蛋白的制备16
二、叶绿体的提取与45SRNA的制备16
三、细菌质粒DNA的提取17
思考题17
参考文献17
第二编纯化方法
第二章 沉淀法20
**节 基本原理与沉淀类型20
一、基本原理20
二、制备蛋白质20
三、制备核酸29
第二节 应用实例32
一、脾磷酸二酯酶的纯化32
二、细菌染色体DNA的制备32
三、蔗糖酶的初步纯化33
思考题33
参考文献34
第三章 吸附层析35
**节 吸附柱层析36
一、常用术语36
二、基本原理37
三、吸附剂38
四、洗脱液41
五、层析柱的制备与层析操作41
六、应用与实例43
第二节 薄层层析45
一、操作及注意事项46
二、应用实例51
第三节 聚酰胺薄膜层析52
一、基本原理52
二、应用实例53
思考题56
参考文献57
第四章 疏水层析58
**节 基本原理58
一、疏水作用58
二、吸附剂59
第二节 操作与应用59
一、层析柱的制备59
二、加样与洗脱60
三、应用实例60
思考题62
参考文献62
第五章 离子交换层析63
**节 基本原理63
第二节 离子交换剂的分类及性质65
一、分类65
二、性质71
第三节 离子交换剂与缓冲液的选择78
一、离子交换剂的选择78
二、缓冲液的选择79
三、加样量的确定82
第四节 操作82
一、离子交换剂的处理、再生和转型82
二、分离物质的交换83
三、物质的洗脱与收集84
第五节 应用86
一、制备、纯化生命物质86
二、测定蛋白质的等电点89
思考题89
参考文献90
第六章 凝胶过滤91
**节 凝胶的分类及性质91
一、葡聚糖凝胶92
二、琼脂糖凝胶94
三、聚丙烯酰胺凝胶95
四、Sephacryl96
五、Superdex97
第二节 基本原理97
第三节 操作100
一、凝胶的选择和处理100
二、凝胶柱的制备101
三、加样与洗脱102
四、凝胶柱的再生及保存106
第四节 应用106
一、脱盐和浓缩106
二、分离生命物质107
三、去除热源物质108
四、测定分子质量108
五、其他111
思考题111
参考文献111
第七章 亲和层析112
**节 基本原理112
第二节 操作114
一、载体的选择114
二、配体的选择115
三、亲和吸附剂的制备116
四、特异性吸附118
五、分离大分子物质120
六、亲和层析柱的再生121
第三节 提高吸附剂的操作容量121
一、在配体和载体间引入“手臂”121
二���增加配体取代的程度123
三、配体与载体衍生物以*少的键连接123
四、载体多孔性的影响123
五、其他124
第四节 应用实例124
一、纯化大分子物质124
二、研究酶的结构与功能127
三、实例128
思考题131
参考文献131
第八章 聚焦层析132
**节 基本原理132
一、多缓冲剂和多缓冲交换剂132
二、聚焦层析原理133
第二节 操作136
一、多缓冲剂的选择136
二、多缓冲交换剂用量的确定136
三、多缓冲交换剂的处理137
四、样品的准备137
五、加样和洗脱137
六、样品中多缓冲剂的去除138
第三节 应用138
一、分离模型蛋白质138
二、分离复杂物质139
三、鉴定某些酶的性质140
思考题141
参考文献141
第九章 **液相色谱142
**节 基本原理143
一、**液相色谱仪143
二、固定相145
第二节 反相**液相色谱148
一、固定相、流动相和色谱柱149
二、纯化糖基化白蛋白肽片段151
第三节 应用153
一、定性和定量分析153
二、测定酶活性154
三、测定蛋白质分子质量154
四、分离核酸和蛋白质155
思考题160
参考文献160
第十章 固定化的酶与微生物161
**节 制备方法162
一、固定化酶162
二、固定化微生物165
三、生物传感器166
第二节 制品的性质167
一、酶的相对活性167
二、活性曲线与*适pH168
三、稳定性169
四、米氏常数170
五、其他170
第三节 应用实例171
一、工业方面171
二、医学方面174
三、生化分析方面175
四、应用实例177
思考题179
参考文献179
第三编鉴定方法
第十一章 标记182
**节 核酸标记182
一、基本原理182
二、标记方法183
第二节 蛋白质标记189
一、机制190
二、类型190
三、标记物制备191
第三节 标记物的纯化与鉴定195
一、标记物纯化196
二、探针的鉴定197
第四节 应用实例201
一、cDNA组学和蛋白质组学201
二、激酶的磷酸化和脱磷酸化205
三、蛋白质半衰期的测定206
思考题207
参考文献207
第十二章 重组DNA208
**节 重组DNA的部件208
一、工具酶208
二、载体211
三、目的基因213
第二节 重组218
一、黏性末端连接法219
二、平端连接法220
三、平黏连接法221
四、TA连接法221
五、同聚物加尾连接法221
六、人工接头连接法221
第三节 DNA扩增223
一、重组DNA导入宿主细胞223
二、重组子的筛选与鉴定225
三、表达产物的纯化227
第四节 应用实例227
一、分离总RNA和mRNA228
二、反转录合成**链cDNA228
三、PCR扩增及其产物纯化228
四、PCR产物的克隆229
五、重组质粒的提取及分析229
思考题230
参考文献230
第十三章 DNA序列测定231
**节 双脱氧链终止法231
一、基本原理231
二、载体系统232
三、测序试剂236
四、测序操作238
五、变性电泳241
六、序列读取242
第二节 PCR法242
一、直接测序243
二、循环测序244
三、应用实例245
第三节 化学降解法246
一、测序原理246
二、具体操作247
第四节 新一代测序法250
一、第二代测序法250
二、第三代测序法252
思考题253
参考文献253
第十四章 生物芯片254
**节 基因芯片254
一、基本原理和工作流程254
二、制备及操作257
三、应用实例262
第二节 蛋白质芯片267
一、原理及特点267
二、制备与操作268
三、应用实例270
第三节 芯片实验室273
一、结构与制作273
二、应用实例276
思考题282
参考文献282
第十五章 聚合酶链反应283
**节 基本原理及操作系统283
一、扩增DNA283
二、扩增RNA290
第二节 PCR的类型294
一、普通PCR294
二、原位PCR295
三、反转录PCR295
四、反向PCR295
五、不对称PCR296
六、巢式PCR296
七、彩色PCR297
第三节 应用297
一、筛选目的基因297
二、直接测序297
三、标记DNA探针298
四、寻找新基因298
五、检测血液和组织成分298
六、检测环境中的致病菌与指示菌298
思考题299
参考文献299
第十六章 电泳300
**节 基本原理301
一、泳动度概念301
二、影响泳动度的因子302
第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳303
一、基本原理303
二、不连续垂直板状和柱状凝胶电泳309
三、连续的垂直板凝胶的电泳319
四、线性和阶梯式梯度的板状凝胶电泳320
五、双向电泳322
第三节 琼脂糖凝胶电泳323
一、缓冲液的配制324
二、琼脂糖胶板的制备324
三、加样和电泳325
四、观察325
第四节 应用325
一、测定分子质量326
二、测定蛋白质等电点328
三、鉴定微量物质333
四、诊断疾病(转移电泳)336
思考题339
参考文献339
第十七章 免疫分析340
**节 抗体的性质、制备及纯化340
一、抗体的性质340
二、多克隆抗体的制备341
三、单克隆抗体的制备346
四、抗体的检测350
五、抗体的纯化352
第二节 抗原抗体反应与应用354
一、凝集反应354
二、免疫扩散357
三、免疫电泳359
四、固相免疫吸附(含ELISA)363
五、免疫微球测定370
思考题372
参考文献373
第十八章 气相色谱374
**节 基本原理374
一、常用术语374
二、塔板与速率理论376
第二节 气相色谱仪的构造379
一、载气流速的控制和测量380
二、进样系统380
三、恒温室380
四、色谱柱380
五、检定器384
第三节 操作385
一、操作要点385
二、条件的选择386
第四节 定性和定量检测386
一、定性检测386
二、定量检测387
第五节 应用390
一、分析蛋白质和氨基酸390
二、分析核酸391
三、分析糖类物质391
四、分析脂肪酸392
五、分析农药392
思考题392
参考文献392
第十九章 分光光度法393
**节 基本原理393
一、光谱393
二、物质结构与光谱的关系394
三、光吸收的基本规律——比尔朗伯定律396
第二节 分光光度计的结构及类型397
一、主要结构397
二、类型400
第三节 应用402
一、定性分析402
二、含量测定404
三、参数测定409
四、物质结构的分析410
思考题410
参考文献411
第二十章 离心法412
**节 基本原理412
一、沉降现象412
二、离心力413
三、离心法413
四、沉降系数415
第二节 离心机的类型及构造416
一、制备型离心机416
二、分析型离心机419
第三节 应用419
一、离心机的操作概述419
二、应用实例421
三、测定沉降系数423
四、分离纯化生命物质424
思考题424
参考文献425
参考文献426
附录435
中英文缩写词448

《生物化学技术原理及应用》适合综合性大学及医、农、师范院校等相关专业本科生和研究生使用,还可供从事生物科学工作的有关人员参考。